Jika ditemukan bahwa seseorang mungkin memiliki masalah di otak atau batang otak dari riwayat medis dan pemeriksaan fisik, maka tes tambahan dapat dilakukan.
Banyak orang akan menjalani CT scan otak, terutama jika orang tersebut terlihat sangat gawat. CT-Scan adalah jenis pemeriksaan dengan sinar-X seperti foto rontgen, namun menunjukkan hasil yang lebih detail dalam tiga dimensi. Biasanya, bahan pewarna, disebut sebagai bahan kontras, disuntikkan ke aliran darah untuk menyoroti kelainan pada saat pencitraan CT-scan.
Orang dengan kanker otak sering memiliki masalah medis lainnya; oleh karena itu, pemeriksaan laboratorium rutin dapat dilakukan. Pemeriksaan laboratorium itu meliputi analisis darah, elektrolit, tes fungsi hati, dan profil pembekuan darah. Jika orang tersebut memiliki status mental berubah sebagai gejala utama, pemeriksaan darah atau urine dapat dilakukan untuk menyingkirkan penggunaan narkoba sebagai penyebab gejala tersebut.
Cara standar untuk mengevaluasi sifat dan kelas tumor otak adalah pemindaian MRI (perhatikan bahwa beberapa rumah sakit tidak memiliki pemindai MRI). MRI memiliki kepekaan yang lebih tinggi untuk mendeteksi adanya tumor dan menilai karakteristik tumor daripada CT-scan. Secara khusus, hubungan tumor dengan jaringan otak di sekitarnya, lapisan otak, ruang cairan serebrospinal, dan struktur pembuluh darah di kepala muncul dengan diagnosis sementara dari sifat tumor. Saat ini, bagaimanapun, banyak institusi yang memiliki pemindai MRI masih menggunakan CT scan sebagai tes skrining untuk tumor, padahal pemindai MRI lebih akurat dalam mengenali tumor otak.
Jika scan CT atau MRI menunjukkan adanya tumor otak, orang tersebut akan dirujuk ke operasi otak (seorang ahli bedah saraf). Jika ada, pasien dapat juga dirujuk ke spesialis terapi radiasi yang disebut onkologi radiasi, dan ahli onkologi medis jika mereka mengkhususkan diri dalam pengobatan kemoterapi kanker otak (ahli medis atau neurologis).
Langkah selanjutnya dalam diagnosis adalah konfirmasi bahwa orang tersebut memiliki kanker di otak. Pemindaian dapat dianggap sangat mencurigakan, atau bahkan sangat mungkin untuk menunjukkan tumor otak, namun konfirmasi memerlukan diagnosis jaringan bila memungkinkan. Sampel kecil tumor (biopsi) diambil untuk mengidentifikasi jenis tumor dan kadar tumor.
Teknik yang paling banyak digunakan untuk mendapatkan biopsi adalah prosedur operasi yang disebut kraniotomi. Tengkorak dibuka, biasanya dengan maksud menghilangkan keseluruhan tumor jika memungkinkan. Biopsi kemudian diambil dari tumor.
Jika ahli bedah tidak dapat mengangkat keseluruhan tumor, sepotong kecil tumor akan diangkat.
Dalam beberapa kasus, biopsi dapat dilakukan tanpa membuka tengkorak. Lokasi tumor yang tepat di otak ditentukan secara stereotip, yaitu dengan menggunakan CT atau MRI scan sementara kepala ditahan masih dalam bingkai CT atau MRI. Sebuah lubang kecil kemudian dibuat di tengkorak dan sebuah jarum dipandu melalui lubang ke tumor. Jarum akan mengambil jaringan untuk dibiopsi dan dikeluarkan. Teknik ini disebut stereotaxis, atau biopsi stereotactic. Proses ini tidak mengobati tumor dan umumnya dilakukan pada kondisi di mana tumor sulit untuk diakses atau dianggap sensitif terhadap terapi radiasi (seperti limfoma saraf pusat atau tumor germ cell pineal) dan pembedahan tidak diperlukan untuk merawat pasien secara memadai.
Jaringan yang telah dibiopsi diperiksa di bawah mikroskop oleh ahli patologi (bidang kedokteran yang mengkhususkan diri dalam diagnosis penyakit dengan melihat sel dan jaringan) dan biasanya diberi grade sesuai klasifikasi NCI.